Teil 2: Trennverfahren · Kapitel 9 · HPLC, RP und Ionenchromatographie

HPLC, RP und Ionenchromatographie

HPLC-Grundlogik

HPLC ist die Methode für nichtflüchtige, thermisch empfindliche oder polare Analyten, die für GC ungeeignet sind. Die Trennung beruht auf Wechselwirkungen zwischen Analyt, mobiler Phase und stationärer Phase.

In der Methodenwahl musst du von Stoffeigenschaften ausgehen:

• Ionen: Ionenchromatographie, Ionenpaarchromatographie oder Ionenaustausch.
• Unpolare bis mäßig polare organische Stoffe: oft RP-HPLC.
• UV-aktive Aromaten: HPLC-UV/DAD naheliegend.
• Fluoreszierende PAK: RP-HPLC plus FLD.
• Nicht UV-aktive Aminosäuren: Derivatisierung plus UV/Fluoreszenz.
• Polymere/Zucker ohne Chromophor: RI oder ELSD erwägen.

Reversed Phase

RP-HPLC nutzt eine unpolare stationäre Phase, typischerweise C18/ODS, C8 oder C4, und eine polarere mobile Phase. Je hydrophober der Analyt, desto stärker die Retention.

Wichtige Details aus den Folien/Fragen:

• C18 ist häufigster Standard.
• C4 kann bei Proteinen sinnvoll sein, ist aber weniger abschirmend; freie Silanolgruppen können stärker zu Tailing beitragen.
• Bei Peptiden/Proteinen ist RP sehr analytisch stark, aber für präparative Proteinaufreinigung oft ungünstig, weil organische Lösungsmittel/saure Bedingungen denaturieren können.
• Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ist für native Proteinreinigung milder: hohe Salzkonzentration fördert Bindung, abnehmende Salzkonzentration eluiert.

Gradient

Gradientenbetrieb bedeutet: die Zusammensetzung der mobilen Phase wird mit der Zeit verändert. Zweck:

• stark zurückgehaltene Substanzen schneller eluieren;
• späte Peaks schmaler halten;
• komplexe Gemische in akzeptabler Zeit trennen;
• Säule am Ende reinigen und danach re-equilibrieren.

Typen:

• Niederdruckgradient: Mischung vor der Pumpe; günstiger, aber träger.
• Hochdruckgradient: mehrere Pumpen mischen nach Druckaufbau; schneller und genauer, aber teurer.

RI-Detektoren sind bei Gradienten problematisch, weil sich der Brechungsindex der mobilen Phase ändert.

HPLC-Detektoren

Anforderungen an gute Detektoren:

• hohe Sensitivität;
• kurze Ansprechzeit;
• stabile Basislinie, wenig Drift;
• hoher linearer Bereich;
• kleine Messzelle, damit keine Bandenverbreiterung entsteht;
• passend selektiv oder universell.

UV/VIS-aktiv sind aromatische und ungesättigte/konjugierte Verbindungen. Je kürzer die Wellenlänge, desto unspezifischer wird die Detektion.

Ionenchromatographie

Ionenchromatographie ist für anorganische Ionen und kleine organische Ionen optimiert. Der Trennprozess beruht auf Konkurrenz um geladene Bindungsplätze.

Für Anionen nutzt man Anionenaustauscher, für Kationen Kationenaustauscher. Retention hängt ab von:

• Ladung des Ions;
• Größe inklusive Hydrathülle;
• Bindungsstärke des Ionenaustauschers;
• pH-Wert;
• Gegenion der mobilen Phase;
• Ionenstärke.

Höhere Ionenstärke verkürzt meist die Retentionszeiten, weil mehr Gegenionen um die Bindungsplätze konkurrieren.

Suppression

Problem der Leitfähigkeitsdetektion: Der Eluent leitet selbst stark. Dadurch ist der Hintergrund hoch und das Signal/Rausch-Verhältnis schlechter.

Lösungen:

• elektronische Unterdrückung: Hintergrund wird rechnerisch abgezogen, kein zusätzliches Säulenvolumen, aber höheres Rauschen;
• chemische Unterdrückung: Suppressor senkt Eluentenleitfähigkeit und erhöht Analytleitfähigkeit.

Beispiel Anionenanalytik:

• Eluent Natriumhydrogencarbonat wird zu Kohlensäure umgesetzt, also geringere Leitfähigkeit.
• Analyt Natriumchlorid wird zu Salzsäure umgesetzt, also höhere Leitfähigkeit.

Vorteile Suppressor:

• höhere Empfindlichkeit;
• Gradientenelution möglich.

Nachteile:

• zusätzliches Totvolumen kann Peaks verbreitern;
• klassische Suppressorsäulen müssen regeneriert werden;
• Mikromembransuppressoren arbeiten kontinuierlich.

Ionenpaarchromatographie

Bei Ionenpaarchromatographie wird der mobilen Phase ein Gegenion zugesetzt. Es bildet mit dem ionischen Analyten ein nach außen weniger geladenes oder neutrales Ionenpaar, das stärker mit einer RP-Phase wechselwirkt.

Typische Reagenzien:

• für kationische Analyten: organische Sulfonate;
• für anionische Analyten: quartäre Ammoniumionen.

Klausurantwort: Das Verfahren macht ursprüngliche Ionen unter RP-Bedingungen retinierbar, kann aber Gleichgewichte, Reproduzierbarkeit und MS-Kopplung erschweren.