Teil 1: Spektroskopie · Kapitel 6 · Massenspektrometrie

Massenspektrometrie

Für Biomoleküle entscheidet die Ionisierung über Messbarkeit. Eine MS-Antwort sollte immer die Komponenten nennen:

Ionenquelle;
m/z-Analysator;
Detektor;
Vakuum;
Signal-/Datenverarbeitung.

Moleküle müssen geladen sein, sonst lassen sie sich nicht mit elektrischen oder magnetischen Feldern beschleunigen/lenken. Vakuum ist nötig, damit Ionen nicht ständig mit Gasmolekülen kollidieren.

m/z Und Ladung

Massenspektren tragen auf der x-Achse (m/z), also Masse-zu-Ladungszahl. Für positive, protonierte Ionen gilt:

\frac{m}{z}=\frac{M+z\,m_H}{z}

mit (m_H\approx1.0073) Da.

Umstellung:

M=z\cdot(m/z)-z\,m_H

Das ist die zentrale Rechnung für ESI-Aufgaben. Bei mehrfach geladenen Ionen liegt ein großes Molekül bei kleinerem m/z. Ein Protein mit 6000 Da und (z=5) erscheint ungefähr bei (m/z=1201).

Originalseite aus der Schrader Musterprüfung mit ESI-MS-Aufgabe zu Angiotensin I

Originalaufgabe aus der Musterprüfung: Ladungszustände, Isotopenabstände und Auflösung sind ein wiederkehrendes MS-Muster.

Isotope

Elemente haben natürliche Isotopenverteilungen. Moleküle erzeugen deshalb Isotopencluster. In organischen/Bio-Molekülen ist besonders ¹³C wichtig: viele C-Atome erhöhen die Wahrscheinlichkeit für M+1-Peaks.

Bei mehrfach geladenen Ionen rücken Isotopenpeaks enger zusammen:

\Delta(m/z)\approx \frac{1}{z}

Typische Klausurdiagnose:

Abstand 1,0: einfach geladen;
Abstand 0,5: zweifach geladen;
Abstand 0,33: dreifach geladen;
Abstand 0,2: fünffach geladen.

Ionisationsmethoden

EI

Elektronenstoßionisation:

M+e^-\rightarrow M^{+\bullet}+2e^-

EI ist hart: Es entstehen viele Fragmente. Das ist für kleine flüchtige Moleküle und Datenbankvergleich nützlich, aber für intakte Biomoleküle meist ungeeignet.

ESI

Elektrospray-Ionisation bringt gelöste Moleküle über geladene Tropfen in die Gasphase. Lösungsmittel verdunstet, Ladung bleibt zurück, Ionen werden ins MS überführt. ESI ist weich und gut mit LC koppelbar.

Typisch:

mehrfach geladene Protein-/Peptidionen;
Ladungszustandsserien;
gut für polare/geladene Moleküle;
empfindlich gegenüber Salzen, Puffern und Matrix.

MALDI

MALDI steht für Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation. Probe und Matrix kristallisieren zusammen. Der Laser wird überwiegend von der Matrix absorbiert; die Matrix unterstützt Desorption und Ionisation und schützt den Analyten.

Typisch:

häufig einfach geladene Ionen;
oft Kopplung mit TOF;
geeignet für Peptide, Proteine, Polymere;
Matrixhintergrund im unteren m/z-Bereich;
Heterogenität der Kristalle kann Reproduzierbarkeit beeinflussen.

Originalfolie zum Vergleich von ESI und MALDI

MALDI-TOF

Bei TOF werden Ionen beschleunigt und ihre Flugzeit gemessen. Bei gleicher Beschleunigung fliegen leichte Ionen schneller als schwere. Vereinfacht gilt:

m/z \sim t^2

In der Vorlesung wird für MALDI oft (z=1) angenommen. Dann entspricht m/z fast der Molekülmasse plus/minus Addukt.

MALDI-TOF-Fragen wollen oft:

Matrixfunktionen nennen;
Achsen des Spektrums erklären;
einfach geladene Peaks skizzieren;
Isotopenmuster/Addukte beachten;
Auflösung beurteilen.

Auflösung

Die massenspektrometrische Auflösung beschreibt, wie gut nahe Peaks getrennt werden:

R=\frac{m}{\Delta m}

Häufig ist (\Delta m) die Halbwertsbreite (FWHM). Beispiel: Peak bei (m/z=1000), FWHM (0,20): (R=5000).

Hohe Auflösung ist wichtig, um Isotopenpeaks, Ladungszustände oder sehr ähnliche Massen zu unterscheiden. Niedrige Auflösung kann Cluster verschmelzen lassen.

m/z-Analysatoren

Analysator	Prinzip	Typische Rolle
Quadrupol	stabiler/instabiler Ionenflug in RF/DC-Feldern	Routine, Selektion, Triple-Quad
TOF/Re-TOF	Flugzeit nach Beschleunigung	MALDI, schnelle Spektren, Q-TOF
Ionenfalle	Ionen speichern und sequenziell auswerfen	MS/MS, Strukturinformationen
Orbitrap/FT-ICR	Frequenzanalyse gespeicherter Ionen	sehr hohe Auflösung/Massengenauigkeit

Routinefragen verlangen meist nicht jedes Detail, aber du solltest Quadrupol, TOF, Ionenfalle und Orbitrap/FT-ICR grob unterscheiden können.

MS/MS

Tandem-MS bedeutet: Ion auswählen, fragmentieren, Fragmente analysieren. Das ist zentral für Peptidsequenzierung, Strukturaufklärung und selektive Quantifizierung in LC-MS/MS.

Bei Triple-Quadrupol:

Q1 selektiert Precursor-Ion;
Q2 fragmentiert in Kollisionszelle;
Q3 analysiert Product-Ionen.

Typische Klausurantworten

“Warum ESI für Proteine?” Weiche Ionisation aus Lösung, mehrfache Ladungen senken m/z in messbaren Bereich, gut mit LC koppelbar.

“Warum MALDI-Matrix?” Absorbiert Laserenergie, vermittelt Desorption, unterstützt Ionisation, schützt Analyt vor direkter harter Laserwirkung.

“Warum Vakuum?” Freie Ionenflugbahnen, weniger Kollisionen, definierte Felder/Flugzeiten.

“Warum Isotopenabstand 0,2?” Ladungszustand (z=5), weil ein Massenzuwachs von 1 Da durch fünf Ladungen auf 0,2 m/z verteilt wird.

Abruf-Quiz

Frage 1 / 5

Ein Peptid mit M=6000 Da ist fünffach protoniert. m/z ungefähr?